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細胞

Heochst 33342 染液  PBS  蒸餾水

400目篩網  流式細胞儀  冰箱

一、細胞培養

懸浮生長的細胞在培養的狀態下加入Heochst 33342 ，終濃度為1 ug/ml； 37℃孵育7-10 min。

二、細胞收集

低溫500 ~ 1 000 r/min離心5min棄去染液。

三、染色

加入1.0 ml PI染液，4℃避光染色15 min。

四、過濾

400目的篩網過濾1次。

五、流式細胞儀分析

Heochst 33342用氪激光激發的紫外線熒光，激發光波波長為352 nm，發射光波波長為400 ~ 500 nm，產生蘭色熒光；PI用氬離子激光激發熒光，激發光波波長為488 nm，發射光波波長大于630 nm，產生紅色熒光。分析蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。

六、結果判斷

在蘭色熒光對紅色熒光的散點圖上，結果為：正常細胞為低藍光/低紅光，凋亡細胞為高藍光/低紅光，壞死細胞為低藍光/高紅光。

1.  在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上，還可見到細胞凋亡區向細胞壞死區遷移的軌跡，可能是凋亡細胞的DNA進一步降解的緣故。

2.  用Heochst 33342染料與細胞孵育的時間不宜過長，一般控制在20 min之內為宜。如果太長可引起Heochst 33342的發射光譜由藍光向紅光的遷移，導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變，從而影響結果的判斷。